Die virale Ätiologie einiger bösärtiger Geschwulstkrankheiten von Mäusen und Vögeln wurde durch Ultrafiltrationen, die den ungefähren Durchmesser der Virionen berechnen ließen, eindrucksvoll demonstriert. Elektronenmikroskopierer wussten nun, wonach sie zu suchen hatten; meistens Objekte eines Duchmessers von 100nm. Das half bei der ersten Identifikation von onkogenen Viren, obwohl später festgestellt wurde, dass viele Mikrovesikel und Komponenten normaler Zellen in einen ähnlichen Größenbereich fallen.
Die Entdeckung Charlotte Friends vom Sloan Kettering Institut, New York, einer roten Leukämie von Mäusen, die durch zellfreie Filtrate übertragen werden kann, illustriert, welche Richtung die Forschung um 1955 nahm. Als ich in dieser Zeit in Dr. Friends Laboratorium zu arbeiten begann, war das Ziel unserer Bemühungen klar. An erster Stelle der EM--Aktivitäten standen etliche Gewebeproben von leukämischen Schweizer Mäusen (Milz, Lymphknoten, Thymus, Knochenmark) und Ultrazentrifugate, die aus zellfrien Filtraten leukämischer Gewebe, welche die Krankheit auf erwachsene Schweizer und DBA/2--Mäuse übertragen konnten, gewonnen wurden. Ultrazentrifugen--Experimente zeigten uns, dass diese Übertragunsaktivität verschwand, wenn man eine durchschnittliche Filterporengröße auf kleiner als 200nm nutzte. Die klassische Thoerie der Ultrafiltration ließ auf eine Größe von etwa 100nm der infektiösen Partikel schließen. Die Untersuchung von Dünnschnitten eingegossener Leukämiegewebe zeigte desöfteren Partikel ungefähr dieses Durchmessers, verbunden mit einer ganzen Bandbreite von Zellen. Diese Partikel waren umgrenzt von einer einschichtigen Membran und hatten einen elektronendichten zentralständigen Kern (oder Nukleotid). Sie hatten eine charakteristische Struktur und einen auffallend konstanten Durchmesser. Soweit wir wussten, glichen diese Partikel keinen bis dahin bekannten Zellkomponenten. Sie glichen jedoch Partikeln, die von anderen in einigen filtrierbaren experimentellen Tumoren identifiziert wurden, und von W. Bernhard als ,,Typ--C'' klassifiziert wurden [4]. Wichtiger noch, entdeckten wir die selben Partikel auch in Ultrazentrifugaten, die aus zellfreien Filtraten gewonnen wurden, die die Krankheit auf geeignete Mäuse übertragen konnten. Anhand dieser Daten stellten wir die Hypothese auf, dass diese Partikel in der Tat onkogene Viren waren, die die von Dr. Friend untersuchte rote Leukämie verursachten [5]. Überraschenderweise wurde das Virus auch (in kleineren Mengen) in Zellen gefunden, die offensichtlich nichts mit dem Leukämie--Prozess zu tun hatten, wie z. B. Knochenmarks--Megakaryozyten. Diese frühen EM--Studien zeigten aber auch, dass kein elektronendichten Partikel von 100nm Durchmesser ein Virus ist, und dass eine solide Charakterisierung der Feinstruktur erforderlich war, um Viren von ,,virus--ähnlichen Partikeln'' zu unterschieden.
Glücklicherweise fügte unsere Untersuchung der Friend--Leukämie der Struktur--Charakterisierung der onkogenen RNA--Viren bald ein neues wichtiges Instrument hinzu. Das Zusammensetzen des Virions erschien als ein Zelloberflächen--Phänomen, bei dem die Membran der infizierten Zelle direkt zu der letzlichen Virushülle beiträgt; ein mehrstufiger Prozess, für das wir das Wort ,,Knospung'' prägten [6]: Viren werden durch einen Knospungsprozess in den interzellulären Raum entlassen. Die EM--Identifikation dieser Virengruppe in anderen bösartigen Geschwulsten wurde nun restriktiver, da die Beobachtung von Knospungspartikeln gefordert wurde. Das half wahrscheinlich, tausende in menschlichen bösartigen Geschwulsten auftretende virusähnliche Partikel auszusondern, mit denen überenthusiastische Elektronenmikroskopierer die Literatur zu kontaminieren versuchten! Zusätzlich erlaubte uns die Beobachtung des Knospungsprozesses eine sichere Identifizierung infizierter Zellen und die Erkenntnis, dass infizierte Zellen perfekt lebensfähig sind, mit keinen ultrastrukturellen Anzeichen einer zytotoxischen Aktivität einer viralen Infektion. Typische Viren wurden häufig bei Zellen beobachtet, die sich gerade mitotisch teilen [7].
Weil naheliegenderweise Menschenexperimente nicht in Frage kamen, ist die Beobachtung von Partikeln in menschlichen Krebszellen, die den gut charakterierten in experimentellen Tumoren ähneln, zwar sehr interessant, aber a priori nicht beweisend. Um 1960 richteten viele Laboratiorien der ganzen Welt ihre Bemühungen auf dieses Ziel, mit immer wieder verbesserten EM--Methoden. In dieser Zeit, bevor die Molekularbiologie entstand, war die EM das beste Instrument zur Identifizierung von Viren in Zellkulturen. Die zentrale Rolle der EM wurde auf der Cold Spring Harbor Conference 1962 anerkannt, als Lwoff, Hörne und Tournier die Klassifikation der Viren anhand ihrer mophologischen Struktur, ermittelt durch die EM, vorschlugen [8].
Während wir unsere Forschungen am Friend--Leukämie--Virus (FLV) fortsetzten, ermutigt von Dr. J. Beard, Duke University, der sich gut mit der Leukose der Vögel auskannte, richteten wir unsere Bemühungen auf den Nachweis (durch EM) der Virämie in leukämischen Mäusen. Der effektivste erste Schritt, um aviane Leukoseviren zu isolieren, war es, nicht mit leukämischen Geweben, sondern mit Blutplasma leukämischer Hühner zu beginnen. Wir fragten uns, ob das auch für Leukämiemäuse zutraf. Das war außerordentlich wichtig für uns, denn die Effektivität unserer frühen Isolationen, beginnend von gleichartigen leukämischen Geweben (Milz, Lymphknoten) war gering. Darum entwickelten wir eine sehr einfache Reinigungsprozedur, die auf den zwei Schritten der Milliporen--Filtration basierten. Eine gelöste Plasmaprobe von 10ml (aus den Blutungen von etwa 25 Mäusen) wurde zuerst mit einer Aspirationsfilterung (0.65µm) gefiltert, dann durch eine Membran von 0.22µm Porenweite gefiltert, das dann mit 30000g und 1:20min zentrifugiert wird. Die resultierende Probe war sehr klein, fast unsichtbar, aber es lohnte sich, sie für eine EM einzubetten. Dünne Abschnitte solcher Proben zeigten das Vorhandensein einer sehr eindrucksvollen Population von typischen und guterhaltenen Viruspartikeln, zusammengedrängt, mit sehr wenig Kontamination [9]. Das war unsere Herangehensweise, 1965 eine Virämie zu demonstrieren ...
Währenddessen investierten viele EM--Krebsforschungsinstitute (das
unter der Leitung von Dr. W. Bernhard in Viliejuif; Dr. A. J. Dalton am
NCI, Bethseda Md; Dr. L. Dmochowski at MD Anderson, Houston TX: und wir
selbst am Sloan Kettering, NY) viel Zeit auf Versuche, Viren in menschlichen
Krebszellen nachzuweisen. ,,Virusähnliche Partikel'' wurden von Zeit
zu Zeit nachgewiesen, überzeugten aber niemanden. Typische Viren wurden
niemals überzeugend demonstriert. Das stand in starkem Kontrast zu
den gut reproduzierbaren Nachweisen (durch EM) in etlichen Leukämien
und Tumoren in Vögeln und Mäusen. Nur sehr wenige Veröffentlicheungen
dokumentierten die negativen Ergebnisse in menschlichen Leukämien
und Krebsen. Haguenau berichtete aber 1959 [10] über die Schwierigkeiten,
irgendwelche typischen Viruspartikel in einer langen Reihe von Brustkrebsproben
zu identifizieren. Bernhard und Leplus [11] konnten 1964 mithilfe der EM
keine Viruspartikel finden, die in Zusammenhang mit Morbus Hodgkin, Lymphosarkomen,
lymphoiden Leukämien und Metastasen standen. Am Sloan Kettering entschied
ich 1965 wegen der absolut negativen Ergebnisse, mit der Sichtung von EM--Aufnahmen
von Proben von Leukämie und Lymphomen auf das Vorhandensein von Viren
aufzugeben. Das wurde auf einer Konferenz über methodische Ansätze
beim Studium der Leukämie, die 1965 am Wistar College abgehalten wurde,
mitgeteilt [12].
Die Veröffentlichungen dieser negativen Ergebnisse konnten
fanatische Virusjäger nicht stoppen! Musste nicht irgendwo eine Erklärung
für diese negativen Resultate zu finden sein? Vielleicht war der Ansatz
EM mit Dünnschnitten nicht der beste Ansatz (obwohl er für Mäuse
perfekt funktionierte). Dünnschnitte anzufertigen war aufwendig und
zeitraubend. Wer hatte noch Zeit dazu, als es zunehmend schwerer wurde,
Forschungsgelder zu bekommen, und pharmazeutische Unternehmen begannen,
Crash--Programme für schnelle Antworten zu finanzieren? Warum versuchen
wir es nicht mit der Färbemethode? Sie ist sehr einfach und sehr schnell!
Und vor allem gab sie schöne Ergebnisse für Viren ohne Hülle
wie Adenoviren und Polyoma. Die Ergebnisse waren ein komplettes Disaster,
weil die zerbrechlichen RNA--Tumorviren (noch nicht Retroviren benannt)
sehr stark durch den Lufttrocknungsprozess beim Negativfärben verfromt
wurden; sie erscheinen nun als Partikel mit einem langen Schwanz! Unglücklicherweise
erscheinen auch viele Zellbestndteile und blasige Fragmente nach dem Lufttrocknungsprozess
als geschwänzte Strukturen. Das Interpretieren dieser ,,geschwänzten''
Partikel als RNA--Viren war deshalb eine Goldgrube für Virusjäger!
Wir zeigten jedoch, dass die ,,geschwäzten'' Virionen Artefakte der
Präparation waren, die durch Kontrolle der Osmolarität und durch
Osmiumfixierung vor dem Negativfärben [13] oder durch Grenzpunkttrocknen
[14] verhindert werden können. Das Chaos, dass durch die Reporte geschwänzter
Strukturen hervorgerufen wurde, schädigten den Ruf der EM für
die Untersuchung von Krebsviren. Kuhmilch und Muttermilch wurden auf geschwänzte
Partikel untersucht, und Sol Spiegelman warnte vor den möglichen Risiken
des Stillens ...
Eine große Entdeckung, die nichts mit EM zutun hatte, änderte die Vorstellung, wie RNA--Tumorviren funktionieren könnten: die Entdeckung der Reversen Transkriptase (RT) von Temin und Baltimore 1970. Es wurde plötzlich verständlich, wie die RNA--Tumorviren Änderungen genetischer Information hervorrufen konnten. Weiterhin blieben diese Viren Kandidaten für mögliche Onkogene, weil sie als nicht zytotoxisch bekannt waren. Den RNA--Tumorviren wurde ein neuer Name gegeben, Retroviren, und das Studium ihrer möglichen Rolle, menschlichen Krebs hervorzurufen, erhielt größzügige staatliche Förderung nach Nixons ,,War on Cancer Act'', was in angsteinflößender Weise das übertraf, was von einer möglicherweise interessanten, aber doch bislang völlig unbewiesenen Hypothese erwartet werden konnte ...
Die Art des Forschens änderte sich nach der Entdeckung der RT 1970 drastisch. Irgendwie wurden die Methoden, die das Feld der Onkologie seit 1950 dominiert hatten, plötzlich durch die allerneuste Mode der Molekularbiologie ersetzt. Ich sah dieser Entwicklung fast wie ein Außenstehender zu, denn aus meiner Sicht war die EM nicht mehr eine erstrangige Methode, die hypothetische Verbindung von Retroviren und menschlichem Krebs zu untersuchen.
Die siebziger Jahre wurden von verschiedenen Ideen dominiert, die nicht des wissenschaftlichen Anspruchs noch vor 10 bis 20 Jahren genügt hätten.
Zum Beispiel:
1. Es wurde akzeptabel zu behaupten, dass biochemische oder immunologische Verfahren, die virale ,,Marker'' identifizieren sollen, ausreichend sein sollen, um eine virale Infektion der untersuchten Zelle zu beweisen, auch wenn die Viren in Krebszellen nicht durch EM darzustellen sind. Solche Marker können Enzyme (RT), Antigene, Proteine oder RNA--Sequenzen sein.
Dass die viralen Partikel niemals gesehen wurden, wurde bequemerweise damit erklärt, dass das virale Genom berets in die Chromosomen der vermeintlich infizierten Zelle integriert sei. Um sich mit einer solchen Interpretation zufriedenzugeben, muss man alles vergessen, was wir durch das Studium von Krebs in Versuchstieren in der Vergangenheit ermittelt haben. Zugegeben, die EM konnte nur die lezten Phasen viraler Replikation zeigen, weil die ersten Phasen nur mikrobiologische Eregnisse beinhalten, die der ultrastrukturellen Sichtbarmachung entgehen. Trotzdem wurde in allen klassischen Modellen (wie Leukose der Vögel und Mäuse) der sichtbare letzte Schritt der Replikation (die Knospung) beobachtet und als unverzichtbar für die Ausbreitung der Infektion von Zelle zu Zelle angesehen.
2. Ein anderer Kurzschluss mit katastrophalen Folgen war die naive Vorstellung, dass jegliches Material des 1.16g/ml--Dichtebandes (der Ultrazentrifugation) Retroviren repräsentiert! Sicherlich sind echte Retroviren in diesem Dichteband zu finden. Aber das heißt nicht, das sämtliches Material, das im 1.16g/ml--Dichteband zu finden ist, retroviraler Natur ist. In den sechziger Jahren wurde ich oft gebeten, mir die 1.16g/ml--Dichtebande von Kollegen anzusehen: ,,Sieh dir das an, es bildet ein scharfabgegrenztes Band, es müssen reine Viren sein!'' Ultrazentrifugate von solchen scharfen Bändern ergaben dann als Dünnschnitte unter dem EM eine extrem Vielfalt von Mikrobläschen und Proteinteilen, aber keine Retroviren. Trotzdem wurde diese Herangehensweise (und wird immer noch) benutzt, um Virusmarker zu identifizieren! Wie traurig ist es, dass eine einfache EM--Kontrolle solcher Bänder (die 2 Tage dauert und ein paar hundert Dollar kostet) diese vollständig irreleitenden Interpretationen verhindert haben könnte, die große Forschungssummen einfach verschwenden ließen.
3. Andere Fragen müssen gestellt werden, wenn Viren aus öberflächlichen Schichten von Kulturen infizierter Zellen gewonnen werden. Wir erinnern uns an die Entdeckung des Epstein--Barr--Virus (EBV) von Epstein 1964 [15] in Kulturen, die aus afrikanischen Burkitt-Lymphomen angelegt wurden. Sie wurde mit EM unterlegt und sofort und richtig als ein Virus der Herpes--Familie klassifiziert. Um dieses DNA--Virus zu identifizieren, war es notwendig, teilweise zerstörte Zellen zu untersuchen, weil dieses Virus offensichtlich einen starken zytotoxischen Effekt hat. In völligem Kontrast dazu haben die Zellen, die Retroviren tragen, eine exzellente Lebensfähigkeit, und die freigesetzten Virionen können leicht aus der oberflächlichen Schicht der Kultur gewonnen werden, ohne das Lymphokine oder andere Wachstumsförderer angewendet werden müssen.
4. Wissenschaftspolitisch gesehen war die Erforschung potentiell onkogener Viren von der Retrovirushypothese dominiert. Staatliche Förderung ging in die gleiche Richtung, aber verstärkt durch die naive Vorstellung, dass Erfolg vor allem von der Menge des eingestzten Geldes abhing! Ungewöhnlich große staatliche Förderung kreierte eine etablierte Retroviren--Forschungs--Gesellschaft. Dieses Unternehmen stellte viele Forschungsjobs zur Verfügung. Die intellektuelle Freiheit, entlang anderer Krebsforschungsrichtungen zu forschen, reduzierte sich schnell, besonders als pharmazeutische Unternehmen begannen, verlockende Verträge für polarisierte Retrovirenforschung anzubieten ... An erster Stelle stand der unter allen Kosten zu erbringende Beweis, dass Retroviren etwas mit Krebs beim Menschen zu tun hatten, immerhin eine Hypothese, die noch in den siebziger Jahren nicht die mindeste Unterstützung genossen hatte. Diese Fehlleitung der Forschung würde sich nicht weiter auswirken, wenn nicht die öffentliche Gesundheit betroffen wäre. Unglücklicherweise gab 1981 das Auftreten von AIDS der Retroviren--Firma die Möglichkeit, diesen akademischen Fehler in eine Tragödie der öffentlichen Gesundheit zu verwandeln. Was nach 1981 geschah, wird allen Lesern der RA sehr gut bekannt sein ... unnötig, darauf weiter einzugehen. Die Ereignisse, die zu der derzeitigen Krise geführt haben, wurden sehr überzeugend von Peter Duesberg [16] gesichtet und analysiert. Ich muss sagen, dass ich Duesbergs Buch mit großer Aufmerksamkeit, aber im Grunde ohne große Überraschung gelesen habe, denn die Art, die Retroviren in den siebziger Jahren zu erforschen, hat den Weg für die ,,Unreine Wissenschaft'' [17] geebnet ...
Bald nachdem die ersten Fälle der ,,Gay related immune deficiency'', Immundefizienz bei Schwulen, von Michael Gottlieb beschrieben wurden, war es für alle Beobachter klar, dass Gallo und Kollegen sich auf das neue Syndrom stürzen würden als eine gottgesandte Gelegenheit, die üppigen Forschungsgelder zu rechtfertigen, die sie in den letzten 10 Jahren erhalten hatten. 1980 wurde die akademische Gemeinschaft zunehmend unzufrieden mit der Abwesenheit von Resultaten im ,,Krieg dem Krebs'' auf der Basis der Retrovirenjagd. Die kleine Episode von HTLV1 war bei weitem nicht genug, die Angst zu mildern, immense Forschungsgelder fehlgeleitet zu haben. Der Fakt, dass das Syndrom (bald aus taktischen Erwägungen in AIDS, erworbenes Immundefizienzsyndrom, umbenannt) nichts mit Krebs zu tun hatte, störte Gallo offenbar wenig. Die häufige Assoziation mit dem Karposi--Sarkom half, diesen Unterschied in den Augen der Öffentlichkeit zu verschleiern.
Von den Medien, speziellen Aktionsgruppen und den Interessen verschiedener Pharmakonzerne dominiert, verlor das AIDS--Establishment den Kontakt zu vorurteilsloser, gut recherchierter Medizinwissenschaft, denn die unbewiesene HIV/AIDS--Hypothese bekam 100% der Forschungsgelder, während alle anderen Hypothese ignoriert wurden. Die Öffentlichkeit und die Ärzteschaft wurden zu dem Glauben gebracht, dass die Anwesenheit von zirkulierenden Antikörpern gleichbedeutend mit Krankheit ist, dass Kochs Postulate veraltet sind, dass 90% aller Fälle einer Infektionskrankheit in Männer vorkommen könnten, dass eine Virämie durch PCR--Verstärkung von RNA--Fragmenten gemessen werden kann, auch wenn virale Partikel nicht nachgewiesen werden können, etc. etc. ...
Zweckmäßigerweise wurde völlig vergessen, dass man schon seit Jahrzehnten weiß, dass Heroinabhängige ihr Immunsystem schädigen, dass Nitratinhalate viele Giftwirkungen zeigen, dass die extreme Giftigkeit des AZT über 20 Jahre lang bekannt ist, dass die bekannten Retroviren niemals zytotoxische Wirkungen haben etc. etc. ... etc....
Und um sicherzustellen, dass das Unternehmen AIDS auch in Zukunft floriert, wurde die Forschung an abweichenden (also nicht HIV--)Hypothesen sorgfältig durch die Kontrolle der Forschungsgelder und der wissenschaftlichen Publikationen verhindert. In den späten Achtzigern wollte ich mein Forschungsprogramm in Toronto um EM--Untersuchungen von Proben von AIDS--Kranken erweitern. Unglücklicherweise war zu diesem Zeitpunkt die Panikmache der Medien und der CDC, dass AIDS eine pestähnliche Seuche ist, so perfekt abgestimmt, dass ich schnell gemerkt habe, dass alle meine Assistenten das Weite gesucht hätten, hätte ich auf solch einem Programm bestanden ... Der HIV--Test war zu diesem Zeitpunkt noch als verlässliche Diagnosemethode anerkannt. Seitdem haben Papadompulos und das australische Forschungsteam gezeigt, dass dies sehr weit von der Wahrheit entfernt ist [18].
Seit meiner Erimetierung in Frankreich versuche ich jede Möglichkeit
zu ergreifen, im Sinne dieses Artikels öffentlich zu sprechen, so
offen und ehrlich ich kann. Ich bin stolz, der ,,Group for the 'Re-appraising
of the HIV-AIDS hypothesis'' (Gruppe für eine Neubewertung der HIV-AIDS
hypothese) anzugehören, und ich hoffe, dass diese Gruppe bald zu einer
vollstandigen Neubewertung der Ätiologie von AIDS beitragen kann,
zum Wohle der Patienten und zur Wiederbelebung der wissenschaftlichen Integrität
der medizinischen Wissenschaft!
2. Claude, A. (1947-1948). Studies on cells: morphology, chemical constitution, and distribution of biochemical functions. The Harvey Lectures, Series XLIII, pp 121-164.
3. Porter KR & Thompson, HP (1948). A particulate body associated with epithelial cells cultured from mammary carcinoma of mice of a milk factor strain. J. Exp. Med.,88:1 5-85.
4. Bernhard, W (1960). The detection and study of tumor viruses with the electron microscope. Cancer Res. 20:712-727.
5. de Harven E. & Friend C. (1958). Electron microscope study of a cell-free induced leukemia of the mouse: a preliminary report. J. Biophys. Biochem. Cytol. 4:151-156.
6. de Harven E. & Friend C. (1960). Further electron microscope studies of a mouse leukemia induced by celf-free filtrates. J. Biophys. Biochem. Cytol. 7:747-752.
7. de Harven, E. (1962). Ultrastructural studies on three different types of mouse leukemia; a review. In "Tumors induced by viruses"pp. 183-206, Academic Press, Inc. New York.
8. Lwoff, A, Hörne, R & Tournier, P (1962). Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 27:51.
9. Friend, C & de Harven, E (1965). A new method for purifying a murine leukemia virus. Fed. Proc. 24, N° 2.
And: de Harven, E. (1965). Viremia in Friend murine leukemia: the electron microscope approach to the problem. Pathologie-Biologie 1 3 (3-4):125-134.
10. Haguenau, F. (1959). Le cancer du sein chez la femme. Etüde comparative au microscope electronique et au microscope optique. Bull. Assoc. Franc. Etüde du Cancer, 46:177-211.
11. Bernhard, W. & Leplus, R. (1964). In "Fine structure of the normal and malignant human lymph node". Pergamon Press, ed., Oxford.
12. de Harven, E. (1965). Remarks on Viruses, Leukemia and Electron Microscopy. ln:"Methodological Approaches to the study of leukemias". Defendi, V. edit.; The Wistar Institute Press, Philadelphia, publ., pp. 147-156.
13. de Harven, E & Friend, C (1964). Structure of virus particles partially purified from the blood of leukemic mice. Virology 23:119-124.
14. de Harven, E , Beju, D. Evenson, DP et al. (1973). Structure of critical point dried oncornaviruses. Virology 55:535-540.
15. Epstein, MA, Achong, BG & Barr, YM (1964). Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's Lymphoma. Lancet 1:702-703.
16. Duesberg, P (1956). "Inventing the AIDS Virus", Regnery Publishing, Inc., Washington DC.
17. Epstein, S (1996). "Impure Science; AIDS, Activism, and the Politics of Knowledge". University of California Press, publ., Berkeley
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